細(xì)胞死亡是所有生物的基本過(guò)程,通過(guò)不同的機(jī)制發(fā)生。程序性細(xì)胞死亡的三種主要類(lèi)型是凋亡、焦亡和壞死,每一種途徑都使用復(fù)雜的分子和細(xì)胞機(jī)制。盡管每種途徑都有特定的機(jī)制和結(jié)果,但它們具有共同的組成部分和特征。
WB實(shí)驗(yàn)中使用到的有三種抗體:一抗、二抗和內(nèi)參抗體。一抗是唯一針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體,可以進(jìn)行制備也可以購(gòu)買(mǎi)現(xiàn)貨,難度系數(shù)較高;二抗直接買(mǎi)就OK,只是需要留意下種屬選擇;內(nèi)參抗體必不可少,是WB實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)控環(huán)節(jié)。
抗體和重組蛋白無(wú)論是保存還是運(yùn)輸,請(qǐng)避免反復(fù)凍融。反復(fù)凍融,冰晶會(huì)破壞抗體和重組蛋白的空間結(jié)構(gòu),導(dǎo)致蛋白變性形成多聚體和重組蛋白構(gòu)象改變,從而降低抗體的結(jié)合能力,也加快了抗體球蛋白和重組蛋白的降解速度。抗體和重組蛋白保存得當(dāng)與否,直接決定了抗體和重組蛋白的活性使用效果,如果保存得當(dāng),抗體和重組蛋白活性大部分都可以維持?jǐn)?shù)年。
PBS緩沖液是一種廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的緩沖溶液,它的全稱(chēng)是Phosphate Buffer Saline (PB),中文通常稱(chēng)為"磷酸鹽緩沖鹽溶液"或者"磷酸鹽緩沖生理鹽水"。這種溶液之所以能夠保持穩(wěn)定的pH值,主要得益于其中的磷酸緩沖對(duì)(H2PO4-和HPO42-)。
白細(xì)胞介素,簡(jiǎn)稱(chēng)白介素,是指在白細(xì)胞或免疫細(xì)胞間相互作用的淋巴因子,它和血細(xì)胞生長(zhǎng)因子同屬細(xì)胞因子。兩者相互協(xié)調(diào),相互作用,共同完成造血和免疫調(diào)節(jié)功能。白細(xì)胞介素在傳遞信息,激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞,介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、增殖與分化及在炎癥反應(yīng)中起重要作用。
流式細(xì)胞術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分子表達(dá)特征的分析,界定不同種類(lèi)的細(xì)胞群,測(cè)定分離出的亞類(lèi)純度,分析細(xì)胞的大小和總量,它可以同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)。它主要用于檢測(cè)標(biāo)記在抗體上的熒光強(qiáng)度,這些熒光抗體則可以檢測(cè)與特定細(xì)胞分子結(jié)合的蛋白或配體,如與 DNA 結(jié)合的溴化丙啶 (PI) 等。
當(dāng)一瓶細(xì)胞裝滿后,進(jìn)行正常處理。 將它均勻地吹進(jìn)培養(yǎng)瓶中,然后鋪上6孔板,每孔2ml。 涂抹后,不用觀察直接用酒精棉擦拭,然后放入培養(yǎng)箱中。 稍微向左三圈,向右三圈,先三圈,然后三圈?;旧希?4小時(shí)后,每個(gè)孔中的細(xì)胞將非常均勻。
在免疫組化反應(yīng)中最重要,包括孵育時(shí)間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種:4℃、室溫、37℃,其中4℃效果最佳;孵育時(shí)間:這與溫度、抗體濃度有關(guān),一般37℃1-2h,而4℃過(guò)夜和從冰箱拿出后37℃復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。
判斷感受態(tài)細(xì)胞制備的優(yōu)劣主要是通過(guò)轉(zhuǎn)化效率來(lái)檢測(cè)。經(jīng)轉(zhuǎn)化外源質(zhì)粒DNA的大腸桿菌在含抗性的LB平板過(guò)夜培養(yǎng)后,平板上長(zhǎng)滿克隆且陰性對(duì)照(未轉(zhuǎn)入外源DNA的感受態(tài))沒(méi)有克隆,證明感受態(tài)細(xì)胞制備良好。