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發(fā)布日期:2023/12/4 10:57:00

  懸浮培養(yǎng)指的是一種在受到不斷攪動或搖動的液體培養(yǎng)基里,培養(yǎng)單細胞及小細胞團的組織培養(yǎng)系統(tǒng),下面一起來了解一下懸浮細胞培養(yǎng)的操作步驟與注意事項。

  一、步驟

  1. 將準備好的凍存細胞放入37℃水浴中解凍。

  2. 用70%乙醇對頂端進行消毒,用吸管將細胞轉(zhuǎn)移到含有5mlwan全MEM-10培養(yǎng)基的25cm2組織培養(yǎng)瓶中,輕輕搖動培養(yǎng)瓶,使細胞均勻分布于培養(yǎng)瓶中,放入5%CO2加濕培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過夜。

  3. 將培養(yǎng)基吸出,用0.5ml37℃的胰酶/EDTA覆蓋細胞,消化30~40s。

  4. 加入10ml旋轉(zhuǎn)瓶wan全培養(yǎng)基-5,并將細胞轉(zhuǎn)移至50ml的離心管中。室溫1800g離心5min,棄上清。

  5. 將細胞沉淀懸浮在5ml的旋轉(zhuǎn)瓶wan全培養(yǎng)基-5中,上下吹打,將細胞團打散。

  6. 在100ml或200ml通氣旋轉(zhuǎn)瓶中加入50ml旋轉(zhuǎn)瓶wan全培養(yǎng)基-5,并將細胞懸液轉(zhuǎn)移到瓶中。

  7. 取出1ml細胞懸液,用血細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)。加入適量的旋轉(zhuǎn)瓶wan全培養(yǎng)基-5,使細胞密度為(3~4)×105細胞/ml。將細胞放入無CO2培養(yǎng)箱,37℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。

  8. 隨后的兩天讓細胞繼續(xù)生長,并且每天對細胞進行計數(shù),加入適量的旋轉(zhuǎn)瓶wan全培養(yǎng)基-5以維持(3~4)×105細胞/ml的細胞密度。

  9. 取1ml的細胞懸液,用血細胞計數(shù)器對細胞進行監(jiān)測。

  10. 當細胞密度達到(4~5)×105細胞/ml時,隔天或每天用培養(yǎng)基將細胞稀釋至1.5×105或2.5×105細胞/ml。

  11. 分別將裝有50ml或100ml細胞懸液的100ml或200ml通氣旋轉(zhuǎn)瓶放入37℃無CO2培養(yǎng)箱旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。每天或隔天傳代。

  二、注意事項

  由于有些細胞是不能被養(yǎng)活的,所以需要高的初始密度。

 

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